2003年，在高希希执导的电视剧《历史的天空》中饰演反一号“万古碑”；2004年，参演电视剧《搭错车》，饰演反一号苏民生。2005年参演电视剧《城市里的春天》，在该剧中饰演的一个典型的现代机关干部 。2007年，出演高希希执导的伦理情感剧《男人底线》，饰演阴冷顽固的赵通达 。2007年参演导演高希希执 导的电视剧《纸醉金迷》，饰演一个投机倒把的奸商 。2009年，在古装剧《三国》中成功饰演刘备 。2010年，于和伟、罗海琼领衔主演亲情剧《幸福在路上》。2010年10月18日林永健、何赛飞、辛柏青、于和伟主演的47集电视连续剧《老马家的幸福往事》举行北京电视台首播发布会。2010年参演电视剧《新三国》，于和伟饰演的刘备 。2011年获南方盛典最佳男演员奖《幸福在路上》 。2011年苏岩、于和伟、王丽坤、沙溢等联袂主演心理谍战剧《青盲》，饰演张海峰 。2012年5月22日获得MSN星月年度最具价值男演员奖。2013年与佟瑞欣、赵恒煊、海顿、王奎荣等主演国内首部浪漫题材谍战戏《奸细》 。2013年与刘威葳、刘钧、吕中、赵亮等演员联合出演家庭情感电视连续剧《大家庭》 。2013年于和伟、王丽坤领衔主演抗日谍战剧《零下三十八度》，剧中饰演的“非典型”特工 。2013年与杨童舒、李依晓、霍青等主演都市亲情戏《天下人家》，剧中，李依晓和于和伟饰演兄妹 。2014年于和伟、刘涛领衔主演的都市情感励志大剧《下一站婚姻》，剧中于和伟变身“恐婚族”，对有着同样离异经历的单身母亲“邓草草”（刘涛饰）暗生情愫 。2014年由刘雪松导演，于和伟、王丽坤、宋春丽等演员领衔主演都市时尚情感剧《爱的多米诺》，在剧中饰演玩具设计师戴谷顺 。2014年于和伟主演《刑警队长》。于和伟在剧中饰演的男主角刑警队长顾铭率领队友屡破大案保卫城市安全，还是一位爱妻儿孝顺父母的好男人。 2015年，于和伟领衔主演的现代青春励志剧《警花与警犬》在北京拍摄 。加盟《极限挑战大电影》拍摄。 主演的电影《过年好》定档大年初一 。2016年，主演三国战争题材权谋古装剧《军师联盟》 。主演都市情感轻喜剧《下一站，别离》 。